Очистка ферментов и методы исследования их каталитических свойств. Климова А.Т.

Активность и получение частично очищенного препарата митохондриальной супероксиддисмутазы печени при экспериментальной термической травме

Очистка ферментов и методы исследования их каталитических свойств. Климова А.Т.
1 Диденко Н.В. 1 Соловьева А.Г. 1 1 ФГБУ «Нижегородский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии» Минздрава России Термическая травма относится к числу патологических поражений, сопровождающихся увеличением свободных радикалов в организме, развитием тканевой гипоксии, изменением активности целого ряда антиоксидантных ферментов.

Целью работы явилось изучение активности супероксиддисмутазы крыс с ожогом, а также получение частично очищенного препарата фермента из митохондрий печени интактных животных и крыс с термической травмой. В работе были использованы крысы самцы линии Wistar, содержащиеся на стандартном рационе вивария.

Экспериментальных животных разделили на 2 группы: контрольную (интактные животные) и опытную (животные с ожогом). Крысам опытной группы наносили ватно-спиртовой ожог. Митохондрии печени получали путем дифференциального центрифугирования. Частично очищенный препарат CОД выделяли с использованием высаливания и ионообменной хроматографии.

Установлено, что активность супероксиддисмутазы в гомогенате и митохондриях печени крыс увеличивается при воздействии ожога (1, 3 и 7 сутки после поражения). Получены частично очищенные препараты митохондриальной супероксиддисмутазы из печени интактных и ожоговых крыс.

При использовании ионообменной хроматографии было показано, что более быстрый выход СОД с колонки происходит у ожоговых животных (3 сутки) по сравнению с интактными. Можно предположить, что термическая травма приводит к изменению пространственной структуры фермента. митохондриальная супероксиддисмутазаионообменная хроматография 1. Гланц С. Медико-биологическая статистика. – М.: Практика, 1999.

 – 459 с.
2. Климова М.А., Епринцев А.Т. Очистка ферментов и методы исследования их каталитических свойств: учебно-методическое пособие для вузов (практикум). – Воронеж: Воронежский государственный университет,2008. – 36 с.
3. Литвицкий П.Ф. Патофизиология: т.1. – М.: ГЕОТАР-Медиа, 2003. – 752 с.
4. Меньщикова Е.Б., Шабалина И.Г.

Генерация активированных кислородных метаболитов митохондриями преждевременно стареющих крыс OXYS // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2002. – Т. 133, № 2. – С. 207–210. 5. Ожоговая аутоинтоксикация. Пути иммунологического преодоления / под ред. Н.А Федорова, Б.Е Мовшева, Р.В. Недошивиной, И.К. Корякиной. – М.: Медицина, 1985. – 256 с.
6. Реммель Н.Н., Кратасюк В.А., Мазняк О.М.

Биолюминесцентный контроль интенсивности патологических окислительных процессов в клетках перфузированной печени крыс после гипертермического воздействия // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2003. – Т.135, № 1. – С. 52–54.
7. Сирота Т.В.

Новый подход в исследовании процесса аутоокисления адреналина и использование его для измерения активности супероксиддисмутазы // Вопросы медицинской химии. – 1999. – Т 45, № 3. – С. 109–116.
8. Чеснокова Н.П., Понукалина Е.В., Бизенкова М.Н. Молекулярно-клеточные механизмы цитотоксического действия гипоксии. Патогенез гипоксического некробиоза // Современные наукоемкие технологии. – 2006. – № 7.

– С. 32–40.
9. Чурилова И.В., Зиновьев Е.В., Парамонов Б.А. Препарат эритроцитарной супероксиддисмутазы «Эрисод»: влияние на уровень обожженных в состоянии ожогового шока // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2002. – Т. 134, № 11. – С. 528–531. 10. Cisnetti F., Lefevre A., Gillot R.

A new pantadentate ligand forms both a di – and mononuclear Mn ǀǀ complex: electrochemical, spectroscopic and superoxiddismutase activity stadies // European journal of inorganic chemistry. – 2007. – Vol. 2007, № 28. – P. 4472–4480.
11. Elchur S., Oberley T. D., Eisenstein R. S.

CuZnSOD deficiency leads to persistent and widespread oxidative damage and hepatocarcinogenesis later in life // Oncogene. – 2005. –Vol. 24. – Р. 367–380.

Термическая травма относится к числу патологических поражений, сопровождающихся увеличением свободных радикалов в организме и развитием тканевой гипоксии, а также изменением активности целого ряда антиоксидантных ферментов, в том числе и супероксиддисмутазы (СОД) [9]. В условиях нормального обмена СОД поддерживает стационарную концентрацию супероксидных радикалов на определенном уровне, защищая тем самым клеточные структуры от их повреждающего действия. Однако в условиях патологического состояния организма, когда число свободных радикалов возрастает, нагрузка на данный фермент резко увеличивается, и данный баланс может быть нарушен. Наиболее выраженное повышение супероксидных анионрадикалов характерно для клеток печени [8]. Поэтому исследование каталитических свойств митохондрий супероксиддисмутазы печени при термической травме является актуальным. Кроме того, изучение свойств очищенного препарата фермента позволит расширить представление о молекулярных механизмах действия термической травмы.

Целью работы явилось изучение активности супероксиддисмутазы крыс с термической травмой, а также получение частично очищенного препарата СОД из митохондрий печени интактных животных и крыс с ожогом.

Материал и методы исследования

В работе были использованы крысы самцы линии Wistar массой 180–230 г., содержащиеся на стандартном рационе вивария. Экспериментальных животных разделили на 2 группы: контрольную (интактные животные) и опытную (животные с ожогом). Крысам опытной группы наносили ватно-спиртовой ожог пламенем на 10 % поверхности спины, экспозицией 45 с [5].

Животных выводили из эксперимента на первые, третьи и седьмые сутки после травмы под эфирным наркозом. Митохондрии печени выделяли методом дифференциального центрифугирования в градиенте плотности сахарозы. Частично очищенный препарат CОД получали с использованием высаливания и ионообменной хроматографии [2].

Активность фермента определяли по ингибированию образования продукта аутокисления адреналина [7].

Результаты исследований подвергали статистической обработке с использованием t-критерия Стьюдента [1].

Результаты исследования и их обсуждение

В клетках печени содержится две формы фермента: Mn-СОД (митохондриальная) и Cu/Zn-СОД (цитоплазматическая). Наибольшей антиоксидантной активностью обладает СОД из митохондрий гепатоцитов крыс.

Определение активности фермента в этих компартментах клеток печени показало, что общая активность СОД в митохондриальной фракции выше активности супероксидисмутазы в гомогенате в среднем в 1,46 раза (рис.

1), что соответствует литературным данным [4, 10].

Рис. 1. Общая активность супероксиддисмутазы (усл.ед./мин) у интактных крыс и животных с термической травмой (1,3 и 7 сутки). Примечание:* – различия статистически значимы по сравнению с контрольной группой (р ≤ 0,05)

При термической травме во все сроки исследования отмечено существенное повышение активности СОД как в гомогенате, так и в митохондриях.

На 1 сутки после нанесения ожога развивается ожоговый шок, к эндогенным воспалительным медиаторам которого относят свободные радикалы кислорода. С увеличением активных форм кислорода в организме возрастает и активность супероксиддисмутазы. Как видно на рис.

1, общая активность СОД в гомогенате опытной группы (1 сутки) оказалась статистически значимо выше активности фермента интактной группы в 3,78 раза.

В митохондриях общая активность супероксиддисмутазы опытных крыс в сравнении с интактными была статистически значимо выше в 2,57 раза.

Полученные результаты показали, что на 3 сутки после нанесения ожога общая активность СОД статистически значимо увеличилась по сравнению с контрольной группой: в гомогенате – в 3,44 раза, в митохондриях – в 2,18 раза.

Третьи сутки после термической травмы соответствуют стадии острой ожоговой токсемии, во время которой происходит дальнейшая активация перекисного окисления липидов, тем самым увеличивая нагрузку на антиоксидантную систему организма.

Согласно литературным данным, на 7 сутки после ожога наблюдается постепенное восстановление метаболизма обожженного животного и возвращение систем к исходному состоянию, что однако занимает очень длительное время [3].

Установлено, что улучшение состояния антиоксидантной системы можно оценить по общей активности супероксиддисмутазы. На 7 сутки после термической травмы активность фермента в гомогенате статистически значимо была ниже по сравнению с первыми и третьими сутками.

Термическая травма характеризуется усилением катаболических процессов, изменением биосинтеза белков и увеличением активности антиоксидантных ферментов.

Основными путями изменения активности ферментов в клетке в ответ на различного рода воздействия являются либо увеличение или уменьшение их количества в клетке, либо конформационные перестройки, возникающие под влиянием внешних и внутренних действующих факторов.

Известно, что пространственная структура белков, в частности, их поверхностный заряд, определяют поведение индивидуальных белков при использовании методов разделения [11].

Результаты выделения и частичной очистки митохондриальной супероксиддисмутазы из печени интактных крыс с использованием высаливания и ионообменной хроматографии представлены в таблице. Для получения частично очищенного препарата СОД из опытной группы животных использовали крыс с термической травмой на 3 сутки после поражения.

Выбор данного периода ожоговой болезни, острой ожоговой токсемии обусловлен нарастанием в это время активности перекисного окисления липидов, увеличением в печени синтеза церулоплазмина, одного из главных антиоксидантов организма.

На 3 сутки после термической травмы преобладает выраженная интоксикация вследствие влияния на организм токсичных продуктов, поступающих из пораженных тканей [6].

Результаты очистки препарата CОД из митохондрий печени крыс контрольной (интактные крысы) и опытной групп (3 сутки после ожога)

Стадии очисткиОбъем, млCодержание белка, мг/млУдельная активность, усл.ед./мин∙мгВыход, %Степень очистки
Интактные3 суткиИнтактные3 суткиИнтактные3 суткиИнтактные3 сутки
Гомогенат20,009,63 ± 0,529,76 ± 1,501,40 ± 0,414,78* ± 0,42100,00100,001,001,00
Митохондрии10,0015,63 ± 0,5810,34 ± 2,431,56 ± 0,625,14* ± 0,6390,0456,991,111,08
Фракционирование (NH4)2SO44,008,60 ± 0,187,53 ± 0,596,54 ± 0,698,67* ± 0,3082,9428,004,671,81
Хроматография на ДЭАЭ-целлюлозе3,007,52 ± 0,327,24 ± 0,288,95 ± 0,5111,35* ± 0,6674,4726,436,392,37

Примечание: * – различия достоверны по сравнению с контрольной группой (р ≤ 0,05).

Как видно из таблицы, использование фракционирования сульфатом аммония и анионообменной хроматографии на ДЭАЭ–целлюлозе позволило получить митохондриальную супероксиддисмутазу со степенью очистки 6,39. Выход фермента составил 74,47 %. Показано, что удельная активность частично очищенного препарата митохондриальной супероксиддисмутазы у интактных крыс в 6,4 раза выше, чем до очистки.

При выделении СОД из печени крыс с термической травмой (3 сутки после поражения) получены следующие результаты: степень очистки – 2,37, выход – 26,43 %. Удельная активность частично очищенного препарата СОД на 3 сутки после ожога превышала активность фермента до очистки на 2,4 раза (таблица).

Таким образом, наибольшая степень очистки фермента была получена при выделении фермента из печени интактных животных (6,39) по сравнению с животными опытной группы (2,37).

На рис. 2 приведен профиль элюции митохондриальной супероксиддисмутазы интактных животных при использовании ионообменной хроматографии. Анализ собранных фракций показал, что максимальное количество белка содержится с 5 по 9 фракцию. Наибольшее количество белка и пик активности приходятся на пробирку № 7.

Из рис. 3 профиля элюции митохондриальной супероксиддисмутазы животных с термической травмой (3 сутки) при использовании ионообменной хроматографии видно, что максимальное количество белка содержится с 4 по 7 фракцию. Наибольшее количество белка и пик активности приходится на пробирки № 4–5.

Известно, что пространственная структура белков, в частности, их поверхностный заряд, определяют поведение индивидуальных белков при использовании методов разделения.

Таким образом, установлено, что активность супероксиддисмутазы в гомогенате и митохондриях печени крыс увеличивается при воздействии ожога (1, 3 и 7 сутки после поражения).

При получении частично очищенного препарата СОД выявлено, что у опытных животных максимальное количество белка и пик активности фермента смещается на более ранние фракции (4–5) по сравнению с интактными крысами (7 фракция).

Это может быть связано с тем, что воздействие термической травмы приводит к конформационным изменениям митохондриальной формы супероксиддисмутазы.

Рис. 2. Профиль элюции белков на ДЭАЭ-целлюлозе и общая активность митохондриальной супероксиддисмутазы (интактные животные)

Рис. 3. Профиль элюции белков на ДЭАЭ-целлюлозе и общая активность митохондриальной супероксиддисмутазы (животные с термической травмой, 3 сутки)

Рецензенты:

Корягин А.С., д.б.н., профессор кафедры физиологии и биохимии человека и животных ГОУ ВПО «ННГУ им. Н.И. Лобачевского», г. Нижний Новгород;

Крылов В.Н., д.б.н., профессор, заведующий кафедрой физиологии и биохимии человека и животных, ГОУ ВПО «ННГУ им. Н.И. Лобачевского», г. Нижний Новгород.

Работа поступила в редакцию 17.05.2013.

Библиографическая ссылка

Источник: https://fundamental-research.ru/ru/article/view?id=31827

Ферменты – биологические катализаторы. Значение ферментов. урок. Биология 10 Класс

Очистка ферментов и методы исследования их каталитических свойств. Климова А.Т.

Ферменты – это белковые молекулы, которые синтезируются живыми клетками. В каждой клетке насчитывается более сотни различных ферментов. Роль ферментов в клетке колоссальна. С их помощью химические реакции идут с высокой скоростью, при температуре, подходящей для данного организма.

То есть ферменты – это биологические катализаторы, которые облегчают протекание химической реакции и за счет этого увеличивают её скорость. Как катализаторы они не изменяют направление реакции и не расходуются в процессе реакции.

Ферментыбиокатализаторы – вещества, увеличивающие скорость химических реакций.

Без ферментов все реакции в живых организмах протекали бы очень медленно и не могли бы поддерживать его жизнеспособность.

Наглядный пример работы ферментов – сладковатый вкус во рту, который появляется при пережевывании продуктов, содержащих крахмал (например, риса или картофеля).

Появление сладкого вкуса связано с работой фермента амилазы, которая присутствует в слюне и расщепляет крахмал (рис. 1).

Крахмал является полисахаридом, и сам по себе безвкусный, но продукты расщепления крахмала (моносахариды) с меньшей молекулярной массой (декстрины, мальтоза, глюкоза) сладкие на вкус.

Рис. 1. Механизм действия амилазы

Все ферменты – глобулярные белки с третичной или четвертичной структурой. Ферменты могут быть простыми, состоящими только из белка, и сложными.

Сложные ферменты состоят из белковой и небелковой части (белковая часть – апофермент, а добавочная небелковая – кофермент). В качестве кофермента могут выступать витамины – E, K, B групп (рис. 2).

Рис. 2. Классификация ферментов по их составу

Фермент взаимодействует с субстратом, не всей молекулой, а отдельной её частью – т. н. активным центром.

Фермент взаимодействует с субстратом и образует короткоживущий фермент-субстратный комплекс. По завершении реакции, фермент-субстратный комплекс распадается на продукты и фермент. Фермент в итоге не изменяется: по окончании реакции он остается таким же, каким был до неё, и может теперь взаимодействовать с новой молекулой субстрата (рис. 3).

Рис. 3. Механизм взаимодействия фермента и субстрата

На рисунке 3 представлен механизм работы фермента, в частности, образования пептидной связи между молекулами аминокислот. Две аминокислоты взаимодействуют между собой в активном центре фермента, между ними образуется пептидная связь. Новое вещество (дипептид) покидает активный центр фермента, поскольку оно по своей структуре не соответствует этому центру.

Особенностью ферментов является то, что они обладают высокой специфичностью, т. е. могут ускорять только одну реакцию или реакции одного типа.

В 1890 году Э. Г. Фишер предположил, что эта специфичность обусловлена особой формой молекулы фермента, которая точно соответствует форме молекулы субстрата.

Эта гипотеза получила название «ключа и замка», где ключ сравнивается с субстратом, а замок – с ферментом. Гипотеза гласит: субстрат подходит к ферменту, как ключ подходит к замку.

Избирательность действия фермента связана со строением его активного центра (рис. 4).

Рис. 4. Гипотеза взаимодействия фермента и субстрата по принципу ключ-замок Э. Г. Фишера

В первую очередь, на активность фермента влияет температура. С повышением температуры скорость химической реакции возрастает. Увеличивается скорость молекул, у них появляется больше шансов столкнуться друг с другом. Следовательно, увеличивается вероятность того, что реакция между ними произойдет. Температура, обеспечивающая наибольшую активность фермента – оптимальная.

За пределами оптимальной температуры скорость реакции снижается вследствие денатурации белков. Когда температура снижается, скорость химической реакции тоже падает. В тот момент, когда температура достигает точки замерзания, фермент инактивируется, но при этом не денатурирует (см. видео).

В наше время для длительного хранения продуктов широко используют способ быстрого замораживания. Оно останавливает рост и развитие микроорганизмов, а также инактивирует ферменты, находящиеся внутри микроорганизмов, и предотвращает разложение продуктов питания.

Кроме этого, активность ферментов зависит ещё от pH среды (кислотности – то есть показателя концентрации ионов водорода).

В большинстве случаев, ферменты работают при нейтральном pH, т. е. при pH около 7. Но существуют ферменты, которые работают либо в кислой и сильнокислой, либо в щелочной и сильнощелочной среде.

Например, один из таких ферментов – пепсин, он находится у нас с вами в желудке, работает в сильнокислой среде и расщепляет белки.

Поскольку в желудке среда достаточно кислая, 1,5 – 2 pH, то этот фермент работает при сильнокислой среде.

Ферменты подвержены действию активаторов и ингибиторов. Некоторые ионы, например, ионы металлов Mg, Mn, Zn активируют ферменты. Другие же ионы (к ним относятся ионы тяжелых металлов, а именно Hg, Pb, Cd), наоборот, подавляют активность ферментов, денатурируют их белки.

В 1961 году была предложена систематическая классификация ферментов на 6 групп. Но названия ферментов оказались очень длинными и трудными в произношении, поэтому ферменты принято сейчас именовать с помощью рабочих названий. Рабочее название состоит из названия субстрата, на который действует фермент, и окончания «аза» (рис. 5).

Например, если вещество — лактоза, то есть молочный сахар, то лактаза – это фермент который его преобразует. Если сахароза (обыкновенный сахар), то фермент, который его расщепляет, – сахараза.

Соответственно, ферменты, которые расщепляют протеины, носят название протеиназы.

Ферменты применяются практически во всех областях человеческой деятельности, и такое широкое применение, в первую очередь, связано с тем, что они сохраняют свои уникальные свойства вне живых клеток.

Ферменты групп амилаз, протеаз и липаз применяются в медицине. Они расщепляют крахмал, белки и жиры. Все эти ферменты, как правило, входят в состав комбинированных препаратов, таких как фестал и панзинорм, и используются, в первую очередь, для лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта (рис. 6).

Ферменты применяют для растворения тромбов в кровеносных сосудах, при лечении гнойных ран.

Особое место занимает энзимотерапия при лечении онкологических заболеваний.

Такие ферменты как амилаза расщепляют крахмал и поэтому широко используются в пищевой промышленности. В пищевой промышленности используется протеиназа, расщепляющая белки, и липазы, расщепляющие жиры. Ферменты амилазы используются в хлебопечении, виноделии и пивоварении (см. видео).

Протеазы используются для смягчения мяса и при изготовлении готовых каш.

Липазы используются в производстве сыра.

Ферменты широко используются в косметической промышленности, входят в состав кремов, некоторые ферменты входят в состав стиральных порошков.

Энзимопатология

Энзимопатология – область энзимологии, которая изучает связь между болезнью и недостаточным синтезом, или отсутствием синтеза какого-либо фермента.

Например, причиной наследственного заболевания – фенилкетонурии, которое сопровождается расстройством психической деятельности, является потеря клетками печени способности синтезировать фермент, катализирующий превращение фенилаланина в тирозин.

В результате в организме накапливаются токсические вещества. Новорожденный ребенок выглядит здоровым, а первые симптомы фенилкетонурии проявляются в возрасте от двух до шести месяцев. Это выраженная вялость, отсутствие интереса к окружающему миру, повышенная раздражительность, а также беспокойство и рвота.

Во втором полугодии жизни у ребенка выражено отставание в психическом развитии. Менее чем в 10% случаев – это слабая степень олигофрении, а у 60% развивается идиотия.

При своевременной диагностике патологических изменений можно избежать, если с момента рождения до наступления полового созревания ограничить поступление фенилаланина с пищей.

Стиральные порошки с ферментами

На этом уроке мы с вами выяснили, что ферменты используются в различных областях человеческой деятельности.

Они широко используются в пищевой промышленности, в медицине, в косметике и бытовой химии.

Например, в стиральные порошки добавляют амилазу, которая расщепляет крахмал, протеазы, расщепляющие белки или белковые загрязнения, и липазы, очищающие ткани от жира и масла.

Как правило, в состав стирального порошка входит комбинация этих ферментов, то есть ферментные препараты усиливают действие друг друга.

Сегодня наиболее изученными ферментами являются протеазы и амилазы. Липазы не всегда стабильны по качеству. Их разработкой занимаются только 10 лет, а амилаза и протеаза существуют на рынке уже более полувека.

Сегодня эти две категории ферментов очень хорошо изучены и дают прекрасные результаты, чего пока что нельзя сказать о липазах.

Липазы полностью справляются с загрязнениями только после двух-трех стирок, а протеазы и амилазы – за одну.

Ученые подсчитали, что добавление ферментов в стиральные порошки на 30-35% увеличивает моющую способность данного порошка.

Ферменты были открыты при изучении процессов брожения. Представления о том, что химические процессы внутри живых организмов протекают под действием каких-то особенных веществ, возникло более 200 лет назад. В XIX века Луи Пастер (рис.

7) доказал, что сбраживание дрожжами сахара в спирт катализируется веществами белковой природы. Пастер ошибочно считал, что ферменты неотделимы от живых клеток.

Другой ученый, Эдуард Бухнер, доказал, что в водных экстрактах живых клеток находится набор ферментов, катализирующих превращение сахара в спирт. Именно его открытие дало начало новой науке – энзимологии.

Успехи энзимологии во второй половине XX века привели к тому, что в настоящее время выделено и очищено более 2000 ферментов, которые используются в различных отраслях человеческой деятельности.

Домашнее задание

1. Что такое фермент?

2. Как ферменты работают?

3. Как ферменты получают имена? Назовите известные вам группы ферментов.

4. Назовите ученых, которые внесли особый вклад в дело изучения ферментов.

5. К какому уровню организации можно отнести ферментативный катализ?

Дополнительные рекомендованные ссылки на ресурсы сети Интернет

1. Интернет-портал Biochemistry.ru (Источник).

2. Биология (Источник).

3. Интернет-портал Chem.msu.su (Источник).

4. (Источник).

5. Вкус жизни (Источник).

Список литературы

1. Каменский А. А., Криксунов Е. А., Пасечник В. В. Общая биология 10-11 класс Дрофа, 2005.

2. Биология. 10 класс. Общая биология. Базовый уровень / П. В. Ижевский, О. А. Корнилова, Т. Е. Лощилина и др. – 2-е изд., переработанное. – Вентана-Граф, 2010. – 224 стр.

3. Беляев Д. К. Биология 10-11 класс. Общая биология. Базовый уровень. – 11-е изд., стереотип. – М.: Просвещение, 2012. – 304 с.

4. Биология 11 класс. Общая биология. Профильный уровень / В. Б. Захаров, С. Г. Мамонтов, Н. И. Сонин и др. – 5-е изд., стереотип. – Дрофа, 2010. – 388 с.

5. Агафонова И. Б., Захарова Е. Т., Сивоглазов В. И. Биология 10-11 класс. Общая биология. Базовый уровень. – 6-е изд., доп. – Дрофа, 2010. – 384 с.

Источник: https://interneturok.ru/lesson/biology/10-klass/bosnovy-citologii-b/fermenty-biologicheskie-katalizatory-znachenie-fermentov

Biz-books
Добавить комментарий