Идентификация и исследование экспрессии генов. Епринцев А.Т

Идентификация и исследование экспрессии генов — pdf скачать бесплатно

Идентификация и исследование экспрессии генов. Епринцев А.Т

1 ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «ВОРОНЕЖСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ» А.Т. Епринцев, В.Н. Попов, Д.Н. Федорин ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ Учебно-методическое пособие для вузов Издательско-полиграфический центр Воронежского государственного университета 2008

2 Утверждено научно-методическим советом биолого-почвенного факультета 14 февраля 2008 г., протокол 6 Рецензент доктор биологических наук, профессор М.А.

Наквасина Учебно-методическое пособие подготовлено на кафедре физиологии и биохимии растений биолого-почвенного факультета Воронежского государственного университета.

Рекомендуется для студентов 3 и 4 курсов дневного обучения биологопочвенного факультета. Для специальности Биология 2

3 Оглавление Раздел 1. Методы работы с нуклеиновыми кислотами Глава I. Выделение и очистка нуклеиновых кислот Работа 1. Методика выделения РНК методом фенол-хлороформной экстракции в присутствии хлорида лития Работа 2. Методика выделения геномной ДНК с использованием СТАВ Работа 3.

Методика быстрого выделения РНК из грамм (-) бактерий. 12 Работа 4. Методика экстракции ДНК из агарозного геля с использованием наборов фирмы QIAEX II Глава II. Определение качественных и количественных показателей нуклеиновых кислот Работа 5. Определение концентрации ДНК или РНК Работа 6.

Определение чистоты препарата ДНК или РНК Работа 7. Методика электрофореза нуклеиновых кислот в агарозном геле Раздел 2. Методы анализа нуклеиновых кислот…. Глава I. Обратная транскрипция Работа 8. Методика проведения обратной транскрипции с использованием фермента M-MuLV Reverse Transcriptase Глава II.

Полимеразная цепная реакция Работа 9. Методика проведения полимеразной цепной реакции Глава III. Полимеразная цепная реакция в реальном времени (Real-Time PCR) Работа 10. Методика амплификации с использованием красителя SYBR Green Работа 11. Методика амплификации ДНК с применением зондов Taqman Работа 12.

Обработка данных Глава IV. Гибридизация нуклеиновых кислот

4 Работа 13. Использование биотин-11-dutp для нерадиоактивного мечения ДНК методом ПЦР Работа 14. Использование биотин-11-dutp для нерадиоактивного мечения ДНК методом удлинения затравки Работа 15. Проведение гибридизации ДНК по Саузерну Работа 16.

Выявление меченых ДНК с образованием нерастворимого окрашенного продукта Работа 17. Дот-блот-гибридизация ПЦР-амплифицированной ДНК Глава V. Клонирование ДНК в бактериальные системы Работа 18. Приготовление компетентных клеток Работа 19.

Трансформация бактериальных клеток методом «холодового шока» Работа 20. Выделение плазмидной ДНК (лизис щелочью) Работа 21. Выделение плазмидной ДНК методом фенол-хлороформной экстракции (экспресс-метод) Работа 22.

Определение вставки ДНК в трансформированных клетках методом рестрикции Работа 23. Идентификация вставки ДНК в трансформированных клетках методом ПЦР

5 Раздел 1.

Методы работы с нуклеиновыми кислотами Исследования в области молекулярной биологии связаны с целенаправленным манипулированием фрагментами нуклеиновых кислот (НК) или целыми генетическими конструкциями, целью которых является получение с помощью лабораторных методов организмов с новыми, в том числе и не встречающимися в природе, комбинациями наследственных свойств. Таким образом, изменение наследственных свойств организма с помощью генной инженерии сводится к конструированию из различных фрагментов нового генетического материала, введения этого материала в рецепиентный организм, создания условий для его функционирования и исследования его уровня экспрессии. В основе молекулярной биологии лежат современные методы физико-химической биологии. Данные методы позволяют получать в чистом виде генетический материал клетки, проводить с ним различные манипуляции, позволяющие идентифицировать как отдельные компоненты, так и целый геном организма. Важным в изучении функционирования живого организма является исследование функциональной активности генетического материала клетки. На первой стадии проведения анализа проба подвергается специальной обработке, в результате которой происходит лизис клеточного материала, удаление белковых и полисахаридных фракций и получение раствора ДНК или РНК, свободного от ингибиторов и готового для дальнейшей амплификации. Выбор методики выделения ДНК (РНК) в основном определяется характером используемого материала. В зависимости от типа биологического материала лизис клеток осуществляется различными способами. Клетки биоматериала разрушаются различными способами, наиболее часто используемым из которых является механическое разрушение. Часто (в случае работы с растительными и 5

6 бактериальными клетками) возникает необходимость применения дополнительных компонентов для избавления от клеточной стенки (лизирующие ферменты, детергенты и т. д.). После разрушения образца возникает необходимость очистки нуклеиновых кислот от других компонентов клеток.

Для этого существуют различные методы, основанные на специфических свойствах нуклеиновых кислот. Наиболее часто используется очистка НК методом фенолхлороформной экстракции, основанной на различной растворимости НК в растворителях разной природы.

Кроме того, применяются методы, основанные на способности НК адсорбироваться на специфических носителях с последующей их элюцией. Глава I. Выделение и очистка нуклеиновых кислот Метод стал широко использоваться для выделения НК из биологических образцов различных источников.

Данный метод позволяет выделять в чистом виде не только суммарною вытяжку НК, но и разделить между собой ДНК и РНК. Принципиальная основа метода заключается в том, что НК имеет высокую растворимость в водной фазе, в то время как большая часть белков, углеводов и других компонентов клетки растворяются в органических растворителях.

На первой стадии происходит суммарное выделение РНК и ДНК, в присутствии гуанидин изотиоционата, ацетата натрия и других компонентов. Гуанидин изотиоционат один из самых мощных денатурантов белка. Очень эффективен при очистке РНК из-за его способности быстро проникать в клетки и подавлять активность РНКаз.

Гуанидин изотиоционат, используемый комбинации со смесью фенол-хлороформ и осаждением спирта, что обеспечивает получение качественной неповрежденной РНК. Кроме того, вместо гуанидин изотиоцианата часто используется додецилсуль- 6

7 фат натрия, также вызывающий лизис клеток и ингибирование клеточных нуклеаз. Применение фенола и хлороформа при выделении НК способствует созданию двухфазной системы. Фенол отделяет белки от ДНК. Хлороформ денатурирует белок и липиды и помогает поддерживать разделение органической и водной фазы, а также делает ДНК менее растворимой в феноле.

При ph 7 8, происходит растворение ДНК и РНК в водной фазе, в то время как белки образуют непрозрачный слой между фазами. В кислых условиях (рн < 5), суммарная РНК остается в верхней водной фазе, в то время как большая часть ДНК и белков остается или в интерфазе, или в органической фазе.

Суммарная РНК впоследствии может быть выделена осаждением с изопропиловым спиртом. Регулируя содержание фенола и его ph, можно добиться разделения ДНК и РНК между собой, при этом ДНК будет находиться в органической фазе, в то время как РНК будет в водной фазе.

На данной стадии возможно добавление изоамилового спирта, чтобы предотвратить вспенивание. Добавление одновалентных катионов (K, Na, NH 4 ) при выделении НК приводит к формированию соли с отрицательно заряженными нуклеиновыми кислотами. Добавление спирта (этанол или изопропиловый спирт) приводит к обратимой денатурации нуклеиновых кислот.

LiCl часто использовался, чтобы денатурировать РНК, хотя осаждение со спиртом и одновалентным катионом типа натрия или иона аммония намного более широко используется. Осаждение LiCl имеет преимущества перед другими методами осаждения РНК, в которых не происходит эффективного удаления ДНК, белок или углеводы.

Другое преимущество состоит в том, что литиевое осаждение эффективно удаляет несвязанные нуклеотидфосфаты, которые учитываются при количественном анализе концентрации методом спектрофотометрии. 7

8 Рис. 1. Схематичный процесс выделения нуклеиновых кислот методом фенол-хлороформной экстракции Существует и иной способ экстракции нуклеиновых кислот, в основе которого лежит способность ДНК и РНК сорбироваться на различного рода носителях (пористое стекло, силикагель, смолы и др.).

Принцип данного метода заключается в сорбции НК на носителе за счет слабых связей (водородные связи, электростатические силы, бисульфидные мостики и т. д.), и последующей их элюцией солевыми растворами с высокой ионной силой.

На основе использования магнитных частиц или других сорбентов на поверхности которых имеются ковалентно связанные poly-т олигонуклеотидные последовательности разной длины, можно выделять чистые препараты мрнк для исследования экспрессионной активности генома образцов. 8

9 Рис 2. Схема выделения нуклеиновых кислот с использованием различного рода сорбентов Работа 1. Методика выделения РНК методом фенол-хлороформной экстракции в присутствии хлорида лития 1. Растворить образец ткани в буфере D (4M гуанидин изотиоционат, 30 мm цитрат натрия, 30 мm β-меркаптоэтанол, ph ). 9

Источник: https://docplayer.ru/31913765-Identifikaciya-i-issledovanie-ekspressii-genov.html

Разработан метод анализа экспрессии генов на уровне индивидуальных клеток

Идентификация и исследование экспрессии генов. Епринцев А.Т

Благодаря новой технологии, за один эксперимент будет возможно изучить активности генов тысяч индивидуальных клеток. Метод CytoSeq позволяет оценить экспрессию произвольного числа генов, вплоть до всего транскриптома клетки.

Мы изучаем жизнь на все более тонких уровнях, однако по-прежнему существует не так много данных, которые можно получить для индивидуальных клеток, а не для клеточной популяции в целом. Анализировать содержание некоторых белков в единичных клетках позволяет метод проточной цитометрии.

С помощью него можно разделять клеточные суспензии на специальных аппаратах, ориентируясь на флуоресценцию введенных в клетки меток*.

Если есть возможность получить антитела, связывающие определенный белок клетки, то, снабдив такие антитела флуоресцентными метками и обработав ими клетки, можно будет оценить яркость свечения каждой отдельной клетки, а значит, и количество целевого белка в ней.

Однако флуоресцирующие антитела можно использовать только к белкам, находящимся на поверхности клетки, так как внутрь живых клеток антитела попасть не могут. Поэтому в анализе содержания белков на уровне отдельных клеток есть определенные ограничения.

Что же касается активности генов, то есть содержания РНК в отдельных клетках, то до недавнего времени методов их анализа просто не было. Чаще всего РНК выделяется из больших количеств клеток, и данные по активности генов, полученные классическими методами — это «средняя температура по больнице».

Если и было показано увеличение активности определенного гена, таким методом невозможно определить, увеличилась ли активность во всех клетках равномерно или же лишь в малой доле клеток, но более резко.

Также невозможно получить точную информацию об исходном количестве клеточной РНК: для регистрации молекул, присутствующих в малых количествах, приходится амплифицировать («умножать») их число с помощью ПЦР, а она может протекать с разной эффективностью.

Чтобы перейти к анализу содержания РНК в отдельных клетках, разрабатываются модификации классических методов, но их использование очень трудоемко, и стоимость знаний о нуклеиновых кислотах из каждой клетки, если их получать такими способами, очень высока [1].

Кроме того, традиционными методами за один эксперимент можно получить информацию о работе лишь ограниченного набора генов. Поэтому важной выглядит новая разработка американских ученых — метод CytoSeq, который позволяет получить информацию об активностях всех генов нескольких тысяч индивидуальных клеток за один эксперимент [2]. Новый метод цитометрии не обходится без этапа секвенирования [3, 4, 5].

Рисунок 1. CytoSeq — метод оценки экспрессии генов индивидуальной клетки.А — Схема метода.

В плашке 100 000 лунок, диаметр лунки 30 мкм, диаметр шарика 20 мкм, количество клеточной суспензии таково, что клетка попадает лишь в каждую десятую лунку. Процедура подробно описана в тексте. Секвенирование — «считывание штрихкода» индивидуальных мРНК.

B — Устройство олигонуклеотидов, прикрепленных к шарикам.

Концевые фрагменты — сайт праймирования для ПЦР и тимидиновый хвостик — одинаковы у всех олигонуклеотидов всех шариков; метка клетки — последовательность, одинаковая у всех молекул одного шарика (одной клетки); метка молекулы — последовательность, специфичная для каждого олигонуклеотида шарика (индивидуальной мРНК). Рисунок из [2], адаптирован.

Основной принцип новой технологии — присвоение каждой клетке и каждой молекуле РНК индивидуального «штрихкода». Для этого клетки сначала разделяют нехитрым способом: размазывают суспензию по плашке с лунками определенного размера, при этом клеток должно быть в 10 раз меньше, чем лунок, чтобы уменьшить вероятность попадания двух клеток в одну лунку.

Затем в каждую лунку к клетке добавляют шарик, к которому прикреплено несколько десятков миллионов фрагментов ДНК (рис. 1). Каждый фрагмент включает в себя последовательность для захвата матричных РНК. Матричные РНК, как известно, несут на 3’-конце регуляторную последовательность из нескольких адениновых нуклеотидов — поли(А)-хвост [6].

Поэтому их можно «выловить» из смеси молекул, используя комплементарную последовательность из нескольких тимидинов, которой и снабжены фрагменты ДНК на шарике. Кроме того, в каждом фрагменте содержится универсальный праймер, с которого вся смесь молекул впоследствии амплифицируется, а затем секвенируется.

А чтобы после этого понять, какая последовательность из какой клетки происходит, а также определить, сколько в ней изначально было копий каждой молекулы, в каждом фрагменте имеются маркеры — нуклеотиды, индивидуальные для шарика, и нуклеотиды, индивидуальные для фрагмента.

После добавления шарика с метками в лунку с клеткой капают лизирующий буфер, который растворяет мембрану и высвобождает клеточное содержимое.

В каждой клетке содержится около 100000 индивидуальных молекул РНК, так что каждая из них получает шанс связаться с одной из меток на поверхности шарика.

Благодаря такому связыванию к каждой молекуле добавляется случайная метка, по которой ее можно отличить, а также метка своего шарика — одна и та же у всех молекул, происходящих из данной клетки. Таким образом и осуществляется «штрихкодирование».

После этого все шарики извлекаются из лунок, и на всей пойманной РНК достраивается комплементарная цепочка ДНК, чтобы было удобнее работать дальше: ДНК более стабильна, чем РНК.

После этого потенциально возможно определить последовательность всех молекул РНК, которые были во всех исследованных индивидуальных клетках. Правда, обойдется это недешево — по подсчетам авторов, в $15 000 на 1000 клеток.

Тем не менее со временем производительность секвенирования, как ожидается, будет расти, а стоимость его — падать, что характерно для большинства технологий [7]. Так что процедура анализа всего транскриптома индивидуальных клеток когда-нибудь станет по карману большему числу лабораторий.

На данный момент авторы рекомендуют ограничиваться анализом работы определенных генов, интересующих исследователей. Ведь даже знание активностей лишь ограниченного их набора в тысячах индивидуальных клеток даст много новых возможностей.

Тем более, взрывной рост объемов баз данных, сопровождающий развитие многочисленных -омик [8], уже сейчас порождает проблемы c обработкой и хранением информации [9].

Для апробации своего метода ученые посмотрели уровни активностей генов цитокинов в Т-клетках после стимуляции рецепторов на их поверхностях [2]. Оказалось, что уровни цитокинов после стимуляции резко повышаются лишь у небольшого числа клеток, причем у каждой из среагировавших клеток растет активность определенного набора генов цитокинов.

С помощью своего метода исследователи обнаружили единичные отреагировавшие на стимуляцию клетки среди нескольких тысяч! Кроме того, стало возможным проследить индивидуальные различия в реакциях этих клеток.

Данные о вкладе отдельных клеток в жизнь популяции помогут нам больше узнать о самых базовых принципах клеточных взаимодействий в организме, механизмах дифференцировки и онкогенеза [1, 9].

Постепенно в научной среде растет доля «сухих» лабораторий, не проводящих экспериментальной работы (это удел лабораторий «мокрых»), а анализирующих и сопоставляющих разные виды данных из биомедицинских баз.

Ведь именно биоинформатика позволяет разгрести авгиевы конюшни документированных по всему миру симптомов, побочных и прямых действий лекарств, всевозможных мутаций, интегрировать данные миллионов пациентов и экспериментов… И получить порой очень неожиданные результаты [10].

Возможно, метод CytoSeq окажет неоценимую услугу «белоручкам» и ускорит «пришествие» Интегративной Биологии, которая будет ворочать огромными массивами разнородных «омических» данных и поспособствует развитию доказательной и становлению персональной медицины.

Источник: https://biomolecula.ru/articles/razrabotan-metod-analiza-ekspressii-genov-na-urovne-individualnykh-kletok

«А.Т. Епринцев, В.Н. Попов, Д.Н. Федорин ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ Учебно-методическое пособие для вузов Издательско-полиграфический центр …»

Идентификация и исследование экспрессии генов. Епринцев А.Т

А.Т. Епринцев,

В.Н. Попов,

Д.Н. Федорин

И ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ

ГЕНОВ Учебно-методическое пособие для вузов Издательско-полиграфический центр Воронежского государственного университета Утверждено научно-методическим советом биолого-почвенного факультета 14 февраля 2008 г.

, протокол № 6 Рецензент доктор биологических наук, профессор М.А. Наквасина Учебно-методическое пособие подготовлено на кафедре физиологии и биохимии растений биолого-почвенного факультета Воронежского государственного университета.

Рекомендуется для студентов 3 и 4 курсов дневного обучения биологопочвенного факультета.

Для специальности 020201 – Биология Оглавление Раздел 1. Методы работы с нуклеиновыми кислотами.

Глава I. Выделение и очистка нуклеиновых кислот.

Работа 1. Методика выделения РНК методом фенол-хлороформной экстракции в присутствии хлорида лития.

Работа 2. Методика выделения геномной ДНК с использованием СТАВ.

Работа 3. Методика быстрого выделения РНК из грамм (-) бактерий.

12 Работа 4. Методика экстракции ДНК из агарозного геля с использованием наборов фирмы QIAEX II.

Глава II. Определение качественных и количественных показателей нуклеиновых кислот.

Работа 5. Определение концентрации ДНК или РНК.

Работа 6. Определение чистоты препарата ДНК или РНК.

Работа 7. Методика электрофореза нуклеиновых кислот в агарозном геле.

Раздел 2. Методы анализа нуклеиновых кислот.

Глава I. Обратная транскрипция.

Работа 8. Методика проведения обратной транскрипции с использованием фермента M-MuLV Reverse Transcriptase.

…………… 22 Глава II. Полимеразная цепная реакция.

Работа 9. Методика проведения полимеразной цепной реакции.

……… 26 Глава III. Полимеразная цепная реакция в реальном времени (Real-Time PCR).

Работа 10. Методика амплификации с использованием красителя SYBR Green.

Работа 11. Методика амплификации ДНК с применением зондов Taqman.

Работа 12. Обработка данных.

Глава IV. Гибридизация нуклеиновых кислот.

Работа 13. Использование биотин-11-dUTP для нерадиоактивного мечения ДНК методом ПЦР

Работа 14. Использование биотин-11-dUTP для нерадиоактивного мечения ДНК методом удлинения затравки.

Работа 15. Проведение гибридизации ДНК по Саузерну.

Работа 16. Выявление меченых ДНК с образованием нерастворимого окрашенного продукта.

Работа 17. Дот-блот-гибридизация ПЦР-амплифицированной ДНК.

…… 49

Глава V. Клонирование ДНК в бактериальные системы.

Работа 18. Приготовление компетентных клеток.

Работа 19. Трансформация бактериальных клеток методом «холодового шока».

Работа 20. Выделение плазмидной ДНК (лизис щелочью).

……………… 58 Работа 21. Выделение плазмидной ДНК методом фенол-хлороформной экстракции (экспресс-метод).

Работа 22. Определение вставки ДНК в трансформированных клетках методом рестрикции.

Работа 23. Идентификация вставки ДНК в трансформированных клетках методом ПЦР.

Раздел 1.

Методы работы с нуклеиновыми кислотами Исследования в области молекулярной биологии связаны с целенаправленным манипулированием фрагментами нуклеиновых кислот (НК) или целыми генетическими конструкциями, целью которых является получение с помощью лабораторных методов организмов с новыми, в том числе и не встречающимися в природе, комбинациями наследственных свойств.

Таким образом, изменение наследственных свойств организма с помощью генной инженерии сводится к конструированию из различных фрагментов нового генетического материала, введения этого материала в рецепиентный организм, создания условий для его функционирования и исследования его уровня экспрессии.

В основе молекулярной биологии лежат современные методы физико-химической биологии. Данные методы позволяют получать в чистом виде генетический материал клетки, проводить с ним различные манипуляции, позволяющие идентифицировать как отдельные компоненты, так и целый геном организма.

Важным в изучении функционирования живого организма является исследование функциональной активности генетического материала клетки.

На первой стадии проведения анализа проба подвергается специальной обработке, в результате которой происходит лизис клеточного материала, удаление белковых и полисахаридных фракций и получение раствора ДНК или РНК, свободного от ингибиторов и готового для дальнейшей амплификации. Выбор методики выделения ДНК (РНК) в основном определяется характером используемого материала.

В зависимости от типа биологического материала лизис клеток осуществляется различными способами.

Клетки биоматериала разрушаются различными способами, наиболее часто используемым из которых является механическое разрушение.

Часто (в случае работы с растительными и бактериальными клетками) возникает необходимость применения дополнительных компонентов для избавления от клеточной стенки (лизирующие ферменты, детергенты и т. д.).

После разрушения образца возникает необходимость очистки нуклеиновых кислот от других компонентов клеток. Для этого существуют различные методы, основанные на специфических свойствах нуклеиновых кислот.

Наиболее часто используется очистка НК методом фенолхлороформной экстракции, основанной на различной растворимости НК в растворителях разной природы.

Кроме того, применяются методы, основанные на способности НК адсорбироваться на специфических носителях с последующей их элюцией.

Глава I. Выделение и очистка нуклеиновых кислот

Метод стал широко использоваться для выделения НК из биологических образцов различных источников. Данный метод позволяет выделять в чистом виде не только суммарною вытяжку НК, но и разделить между собой ДНК и РНК.

Принципиальная основа метода заключается в том, что НК имеет высокую растворимость в водной фазе, в то время как большая часть белков, углеводов и других компонентов клетки растворяются в органических растворителях.

На первой стадии происходит суммарное выделение РНК и ДНК, в присутствии гуанидин изотиоционата, ацетата натрия и других компонентов. Гуанидин изотиоционат – один из самых мощных денатурантов белка.

Очень эффективен при очистке РНК из-за его способности быстро проникать в клетки и подавлять активность РНКаз.

Гуанидин изотиоционат, используемый комбинации со смесью фенол-хлороформ и осаждением спирта, что обеспечивает получение качественной неповрежденной РНК.

Кроме того, вместо гуанидин изотиоцианата часто используется додецилсульфат натрия, также вызывающий лизис клеток и ингибирование клеточных нуклеаз.

Применение фенола и хлороформа при выделении НК способствует созданию двухфазной системы. Фенол отделяет белки от ДНК. Хлороформ денатурирует белок и липиды и помогает поддерживать разделение органической и водной фазы, а также делает ДНК менее растворимой в феноле.

При pH 7–8, происходит растворение ДНК и РНК в водной фазе, в то время как белки образуют непрозрачный слой между фазами.

В кислых условиях (рН 5), суммарная РНК остается в верхней водной фазе, в то время как большая часть ДНК и белков остается или в интерфазе, или в органической фазе. Суммарная РНК впоследствии может быть выделена осаждением с изопропиловым спиртом.

Регулируя содержание фенола и его pH, можно добиться разделения ДНК и РНК между собой, при этом ДНК будет находиться в органической фазе, в то время как РНК будет в водной фазе.

На данной стадии возможно добавление изоамилового спирта, чтобы предотвратить вспенивание.

Добавление одновалентных катионов (K, Na, NH4) при выделении НК приводит к формированию соли с отрицательно заряженными нуклеиновыми кислотами. Добавление спирта (этанол или изопропиловый спирт) приводит к обратимой денатурации нуклеиновых кислот.

LiCl часто использовался, чтобы денатурировать РНК, хотя осаждение со спиртом и одновалентным катионом типа натрия или иона аммония намного более широко используется. Осаждение LiCl имеет преимущества перед другими методами осаждения РНК, в которых не происходит эффективного удаления ДНК, белок или углеводы.

Другое преимущество состоит в том, что литиевое осаждение эффективно удаляет несвязанные нуклеотидфосфаты, которые учитываются при количественном анализе концентрации методом спектрофотометрии.

Рис. 1. Схематичный процесс выделения нуклеиновых кислот методом фенол-хлороформной экстракции Существует и иной способ экстракции нуклеиновых кислот, в основе которого лежит способность ДНК и РНК сорбироваться на различного рода носителях (пористое стекло, силикагель, смолы и др.).

Принцип данного метода заключается в сорбции НК на носителе за счет слабых связей (водородные связи, электростатические силы, бисульфидные мостики и т. д.), и последующей их элюцией солевыми растворами с высокой ионной силой.

На основе использования магнитных частиц или других сорбентов на поверхности которых имеются ковалентно связанные poly-Т олигонуклеотидные последовательности разной длины, можно выделять чистые препараты мРНК для исследования экспрессионной активности генома образцов.

–  –  –

Работа 1. Методика выделения РНК методом фенол-хлороформной экстракции в присутствии хлорида лития

1. Растворить образец ткани в буфере D (4M гуанидин изотиоционат, 30 мM цитрат натрия, 30 мM -меркаптоэтанол, pH 7.0–7.5).

2. Поместить пробирку на лёд. Добавить один объём фенола и перемешать. Добавить 1/5 объёма смеси хлороформ : изоамиловый спирт (24 : 1) и перемешать образец. Перемешать на вортексе ещё 4 раза по 1 мин.

Между перемешиваниями пробирки инкубировать на льду.

3. Открутить на максимальной скорости при 4 °С в течение 30 мин.

Верхнюю (водную) фазу перенести в новую пробирку.

4. Добавить 1 мкл соосадителя и 2 объёма 96 % этанола. Перемешать на вортексе и немедленно открутить на максимальной скорости при RT в течение 10 мин.

5. Промыть осадок 80 % этанолом и высушить на воздухе до исчезновения следов спирта. Не пересушивать!!!

6. Растворить осадок в 100 мкл деионизованной воды. Добавить равный объём 12М LiCl и охладить раствор в течение 30 мин при –20 °С.

7. Открутить на максимальной скорости 15 мин при комнатной температуре. Промыть осадок 0.8 мл 80 % этанола.

8. Осадок высушить, как описано ранее, и растворить в 40 мкл деионизованной воды, свободной от РНКаз.

9. Определить концентрацию и чистоту полученного препарата РНК.

Источник: http://pdf.knigi-x.ru/21metodichka/223525-1-at-eprincev-popov-fedorin-identifikaciya-issledovanie-ekspressii-genov-uchebno-metodicheskoe-po.php

А.Т. Епринцев, В.Н. Попов, Д.Н. Федорин ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ Учебно-методическое пособие для вузов Издательско-полиграфический центр Воронежского государственного

Идентификация и исследование экспрессии генов. Епринцев А.Т

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ

Biz-books
Добавить комментарий